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蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤

关键词: 初中化学 来源: 初中学习网


蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤

一、注意事项:

1. 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度,溶液pH值越接近蛋白的等电点,蛋白质越容易沉淀。

2. 盐析一般用的硫酸铵,容易吸潮,因而在使用前,一般先磨碎,平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量,这样更准确。

3. 在加入盐时应该缓慢均匀,搅拌也要缓慢,越到后来速度应该更注意缓慢,如果出现一些未溶解的盐,应该等其完全溶解后再加盐,以免引起局部的盐浓度过高,导致酶失活。

4. 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了避免盐对酶的影响,一般脱盐处理后再测酶活性。

5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理,以免变性,透析较慢,一般可用超滤或者G-25,G-50 处理。

6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。

二、实验步骤:

蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵,由下表可以看出:它的优点是温度系数小而溶解度大(20度时饱和溶液为754克/升;0度时饱和溶解度为706克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。

表1 几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水)

0℃

20℃

80℃

100 ℃

(NH4)2SO4

70.6

75.4

95.3

103

Na2SO4

4.9

18.9

43.3

42.2

NaH2PO4

1.6

7.8

93.8

101

饱和硫酸铵法:

1. 取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。

2. 4℃,3h以上,使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

3. 置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。

4. 对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入透析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。


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